KAMIYA KT-26867說明書

KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY

人蛋白零點，髓鞘 (MPZ) ELISA

用于定量測定組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液中的人 MPZ

目錄號編號KT-26867

僅供研究使用。不得用于診斷程序。

產(chǎn)品信息

人蛋白零點，髓鞘 (MPZ) ELISA

目錄號編號KT-26867

Human Protein Zero, Myelin

(MPZ) ELISA

預期用途

該試劑盒是一種夾心酶免疫分析法，用于體外定量測定組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液中的人 MPZ。僅供研究使用。不適用于  用于診斷程序。

組件

需要但未提供的材料

• 帶有 450±10 nm 濾光片的酶標儀。
• 精密單通道和多通道移液器和一次性吸頭。
• 用于稀釋樣品的 Eppendorf 管。
• 去離子水或蒸餾水。
• 吸水紙吸干微量滴定板。
• 清洗液容器。

儲存

所有試劑應根據(jù)小瓶上的標簽進行保存。接收后，校準品、檢測試劑 A、檢測試劑 B 和 96 孔板條應儲存在-20 ℃。未使用的試劑條應保存在密封袋中，并提供干燥劑，以盡量減少暴露于潮濕空氣中。開封的檢測試劑盒將在所示失效日期前保持穩(wěn)定，前提是其按照上述規(guī)定儲存。

原理

該試劑盒中提供的微量滴定板已用 MPZ 特異性抗體預包被。然后將校準品或樣品加入到含有 MPZ 特異性生物素結(jié)合抗體制劑的適當微量滴定板孔中。然后，向每個微孔板小孔中加入與辣根過氧化物酶 (HRP) 結(jié)合的抗生物素蛋白并孵育。然后向各孔中加入 TMB 底物溶液。只有那些含有 MPZ、生物素偶聯(lián)抗體和酶偶聯(lián)抗生物素蛋白的孔才會出現(xiàn)顏色變化。

加入硫酸溶液終止酶-底物反應，并采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波長處測定顏色變化。然后通過比較樣品的 O.D. 值與校準曲線，測定樣品中 MPZ 的濃度。

樣本采集和儲存

組織勻漿

組織勻漿的制備因組織類型而異。對于本試驗，在冰冷 PBS (0.02 mol/L，pH 7.0-7.2) 中沖洗組織，以*除去過量血液，并在勻漿前稱重。將組織制成小塊，置于冰上，用玻璃勻漿器在 5-10 mL PBS 中勻漿化（Micro tissue Grinders 也工作）。用超聲細胞破碎儀對所得混懸液進行超聲處理或進行兩次凍融循環(huán)以進一步破碎細胞膜。然后，將勻漿在 5,000 xg 下離心 5 min。立即除去上清液并進行試驗，或等分并儲存在≤-20 ℃ 下。

細胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液

以 1,000 xg 離心樣品 20 min。立即除去微粒并進行測定，或?qū)悠返确衷嚇觾Υ嬖?20 ℃ 或-80 ℃ 下備用。避免反復凍融循環(huán)。

注：

1. 5 天內(nèi)使用的樣品可在 4 ℃ 下儲存，否則樣品必須在-20 ℃（≤1 個月）或-80 ℃（≤2 個月）下儲存，以避免生物活性損失和污染。

• 樣本溶血會影響結(jié)果，因此溶血標本無法檢出。
• 進行分析時，將樣品緩慢恢復至室溫。

試劑制備

使用前，將所有試劑盒組分和樣本置于室溫 (18-25 ℃) 下。

校準品

用 0.1 mL 校準品稀釋液復溶校準品，在室溫下保持 10 min，輕輕振搖（不要起泡）。儲備液中校準品的濃度為 10 ng/mL。請制備 7 支含 0.5 mL 校準品稀釋液的試管，并根據(jù)下圖制備雙倍稀釋系列。在下一次轉(zhuǎn)移前，充分混合各試管。設置 7 個點的稀釋校準品，如 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL，后一個含有校準品稀釋液的 EP 管作為空白 (0 ng/mL)。

試驗稀釋劑 A 和 B

用 6 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 6 mL 試驗稀釋劑 A 或 B 濃縮液 (2X)，制備 12 mL 試驗稀釋劑 A 或 B。制備的工作稀釋液不能冷凍。

檢測試劑 A 和 B

使用前短暫旋轉(zhuǎn)或離心儲備檢測試劑 A 和檢測試劑 B。分別用工作試驗稀釋劑 A 或 B 稀釋至工作濃度 (1:100)。

清洗溶液

用 580 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 20 mL 清洗液濃縮液 (30X)，制備 600 mL 清洗液 (1X)。

TMB 底物

用無菌吸頭吸取所需劑量的溶液，不得將殘留溶液再次倒入小瓶中。

注：

1. 不允許在孔中直接進行連續(xù)稀釋。

2. 在測定前 15 min 內(nèi)制備校準品。請勿在 37 ℃ 下直接溶解試劑。

• 請按照說明仔細復溶校準品或工作檢測試劑 A 和 B，避免起泡并輕輕混合，直至晶體*溶解。為盡量減少移液引起的不精密度，應使用小體積并確保移液器經(jīng)過校準。建議抽吸 10µL 以上，用于一次移液。

4. 復溶的校準品、檢測試劑 A 和檢測試劑 B 只能使用一次。

5. 如果在清洗溶液濃縮液 (30X) 中形成晶體，則加熱至室溫并輕輕混合，直至晶體*溶解。

6. 試劑配制用水或容器受污染會影響檢測結(jié)果。

樣品制備

• Kamiya Biomedical Company 僅對試劑盒本身負責，不對檢測過程中消耗的樣本負責。用戶應計算整個測試中可能使用的樣本數(shù)量。請?zhí)崆邦A留足夠的樣本。

2. 請在測定前預測濃度。如果這些值不在校準曲線范圍內(nèi)，則用戶必須確定其特定實驗的宜樣本稀釋度。

3. 如果手冊中未指明樣本，則需要進行初步實驗以確定試劑盒的有效性。

4. 用化學裂解緩沖液制備的組織或細胞提取樣品，由于某些化學物質(zhì)的影響，可能會引起意想不到的 ELISA 結(jié)果。

• 由于其他來源的抗原可能與我們試劑盒中使用的抗體不匹配（例如，抗體靶向構(gòu)象表位而不是線性表位），我們的產(chǎn)品可能無法識別其他生產(chǎn)商的一些天然或重組蛋白。

6. 受細胞活性、細胞數(shù)量和取樣時間等因素的影響，試劑盒可能無法檢測細胞培養(yǎng)上清液樣本。

7. 建議使用未經(jīng)長期儲存的新鮮樣本進行試驗。否則，這些樣品可能發(fā)生蛋白質(zhì)降解和變性，終導致錯誤的結(jié)果。

試驗程序

• 測定稀釋校準品、空白和樣本孔。校準品制備 7 孔，空白制備 1 孔。向適當孔中分別加入 100µL 校準品稀釋液（讀取試劑制備液）、空白和樣本。用封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 2 小時。

2. 清除每個孔中的液體，不要清洗。

• 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 A 工作溶液。用封板覆膜覆蓋后，在 37 ℃ 下孵育 1 小時。

• 吸取溶液，使用噴射瓶、多通道移液器、歧管分配器或自動清洗器用 350µL 1X 清洗液清洗每個孔，靜置 1-2 min。通過將平板卡在吸水紙上，*去除所有孔中的剩余液體。重復 3 次。后一次洗滌后，通過抽吸或傾析去除任何剩余的洗滌緩沖液。倒置平板，在吸水紙上吸干。

• 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 B 工作溶液。用封板覆膜覆蓋后，在 37 ℃ 下孵育 30 min。

6. 按照步驟 4 重復抽吸/清洗過程 5 次。

• 向各孔中加入 90µL 底物溶液。用新的封板機蓋住。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min（不得超過 30 min）。避光保存。加入底物溶液后，液體將變?yōu)樗{色。

• 向各孔中加入 50µL 終止液。加入終止液后，液體將變?yōu)辄S色。輕敲微孔板一側(cè)，混勻液體。如果顏色變化不均勻，輕敲平板以確保充分混合。

• 除去任何一滴水和平板底部的指紋，并確認液體表面無氣泡。然后，運行酶標儀，立即在 450 nm 處測定。

注：

• 試驗制備：保留適當數(shù)量的條帶用于 1 次實驗，并從微量滴定板中取出額外的條帶。取出的試劑條應重新密封，并在-20 ℃ 下儲存，直至試劑盒失效日期。
• 樣本或試劑添加：請使用新鮮制備的校準品。請小心地將樣品加入孔中，并輕輕混合以避免起泡。盡可能不要接觸孔壁。對于程序中的每個步驟，將試劑或樣本添加到測定板的總分配時間不應超過 10 min。這將確保每個移液步驟的運行時間相等，不會中斷。盡管不要求，但建議重復檢測所有校準品和標本。為避免交叉污染，在每個校準品水平添加之間、樣本添加之間和試劑添加之間更換移液器吸頭。此外，每種試劑使用單獨的儲液器。
• 孵育：為確保結(jié)果準確，孵育步驟期間必須適當粘附封板覆膜。在各孵育步驟之間，請勿使微孔長時間處于未覆蓋狀態(tài)。試劑加入微孔板條后，在檢測過程中的任何時間都不要讓板條變干。必須觀察培養(yǎng)時間和溫度。
• 清洗：清洗程序至關(guān)重要。每個步驟*去除液體對于良好性能至關(guān)重要。后一次清洗后，通過抽吸或傾倒除去任何剩余的清洗液，并除去平板底部的水滴和指紋。清洗不充分將導致精密度較差和吸光度讀數(shù)假性升高。
• 反應時間的控制：觀察加入 TMB 底物后顏色的變化（如 10 min 觀察一次），如顏色過深，應提前加入終止液，避免反應過強而導致吸光度讀數(shù)不準確。

6. TMB 底物容易被污染。請避光保存。

7. 小于 60% 的環(huán)境濕度可能會對終性能產(chǎn)生一些影響，因此，建議在該條件下使用濕化器。

結(jié)果計算

計算各校準品、質(zhì)控品和樣本重復兩次讀數(shù)的平均值，并減去平均零校準品光密度。在 log-log 圖形紙上創(chuàng)建校準曲線，y 軸為 MPZ 濃度，x 軸為吸光度。通過校準品點繪制宜擬合直線，可通過回歸分析確定。還建議使用一些 plot 軟件。如果樣本已被稀釋，則從校準曲線中讀取的濃度必須乘以稀釋因子。

性能

檢測范圍

0.156–10 ng/mL。

用于 ELISA 的校準曲線濃度為 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL。

靈敏度

人 MPZ 的小可檢測劑量通常低于 0.052 ng/mL。本試驗的靈敏度或檢測下限 (LLD) 定義為可與零區(qū)分的低蛋白濃度。測定零校準品 20 次重復測定的平均 O.D. 值加上 3 個標準差。

特異性

該方法檢測人 MPZ 具有較高的靈敏度和*的特異性。未觀察到人 MPZ 和類似物之間存在顯著的交叉反應性或干擾。

注：受當前技能和知識的限制，我們不可能完成人 MPZ 與所有類似物的交叉反應檢測，因此交叉反應可能仍然存在。

分析方法總結(jié)

1. 準備所有試劑、樣本和校準品；

2. 向每個孔中加入 100µL 校準品或樣本。在 37 ℃ 下孵育 2 小時；

3. 加入 100µL 制備好的檢測試劑 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小時；

4. 抽吸并清洗 3 次；

5. 加入 100µL 制備好的檢測試劑 B。在 37 ℃ 下孵育 30 min；

6. 抽吸并清洗 5 次；

7. 加入 90µL 底物溶液。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min；

8. 加入 50µL 終止液。立即在 450 nm 處讀數(shù)。

重要說明

1. 終的實驗結(jié)果將與終端用戶的操作技能和實驗環(huán)境密切相關(guān)。請確保有足夠的樣本可用。

• 不同批次的試劑盒在檢測范圍、靈敏度和顯色時間上可能略有不同。請嚴格按照試劑盒隨附說明書進行實驗，同時使用我們網(wǎng)站的電子版（www.k-assay。。ｃｏｍ）僅供參考。

3. 請勿將一批試劑盒中的試劑混合或替換為另一批試劑盒。僅使用制造商提供的試劑。

4. 儲存和孵育期間，所有試劑均應避免強光照射。所有試劑瓶蓋應蓋緊，防止微生物蒸發(fā)和污染。

• 一次開板時孔內(nèi)可能有一些霧狀物質(zhì)。不會對終試驗結(jié)果產(chǎn)生任何影響。在需要之前，請勿從儲存袋中取出微量滴定板。
• 試劑制備和上樣過程中的錯誤操作，以及酶標儀參數(shù)設置不正確可能導致結(jié)果不正確。在 450±10 nm 波長下，帶寬為 10 nm 或更低、光密度范圍為 0-3 O.D. 或更高的酶標儀可用于吸光度測量。實驗前請仔細閱讀說明書并調(diào)整儀器。
• 即使是同一個操作員也可能在兩個獨立的實驗中得到不同的結(jié)果。為了獲得更好的重現(xiàn)性結(jié)果，應控制試驗中每個步驟的操作。此外，建議在各批次測定前進行初步實驗。
• 每個試劑盒均通過了嚴格的質(zhì)量控制檢測。然而，由于一些非預期的運輸條件或不同的實驗室設備，終端用戶的結(jié)果可能與我們的內(nèi)部數(shù)據(jù)不一致。不同批次試劑盒之間的批內(nèi)方差也可能由上述因素引起。
• 來自不同生產(chǎn)商的相同產(chǎn)品的試劑盒可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果，因為我們尚未將我們的產(chǎn)品與其他生產(chǎn)商進行比較。
• 建議與該試劑盒一起使用的終止液為酸性溶液。使用本材料時，請佩戴眼睛、手、面部和衣物。

僅供研究使用。不得用于診斷程序。